В ветке "Удивительные фотографии под микроскопом" обещал написать о стекниге (встречал еще термин "мультифокус"), точнее о своем опыте в этом деле.

Итак. Чем больше увеличение объектива, тем меньше у него глубина резкости. Привлекательна мысль использовать стекинг с объективами больших увеличений. Однако именно с такими объективами возникает ряд трудностей. И я поясню их на примере с объективом Carl Zeiss Jena APO 90x/1.30.

Должен сразу оговориться, что мои представления о цифровой фотографии и обработке графических изображений скорее интуитивны и, наверняка, примитивны. Я высказываюсь только о собственных опытах с имеющимися у меня оборудованием и программами.

Поскольку вопрос об оборудовании ИМХО является очень важным, то начну с него. У меня, к сожалению, нет фотокамеры с полноразмерной матрицей. В моем распоряжении есть только вэб-камера CANYON CNR WCAM820; матрица которой имеет размер 1/3”, т.е. 4,8х3,6 мм.

Размер матрицы имеет важнейшее значение для микросъемки, гораздо большее, чем число мегапикселей. И вот почему. Наилучшим вариантом для микрофотосъемки является следующий: установить в микроскоп объектив планапохроматической коррекции с ХРУ=0% и разместить в его фокусе матрицу камеры; никакой промежуточной оптики между объективом и камерой при этом не требуется (если объектив на тубус бесконечность – то будет еще тубусная линза), при этом в изображение не вносится дополнительных искажений. Размер изображения в фокусе микрообъектива порядка 20 мм в диаметре (размер коллективной линзы окуляра 7х). Какую часть поля зрения может передать моя камера с матрицей 4,8х3,6 мм? Примерно 5,5%! Поэтому для малоразмерных матриц применяют адаптеры с оптикой, которые выполняют функцию редуктора, сжимая размер изображения до размера матрицы (конечно, внося при этом дополнительные искажения!). Я в своей съемке использую в качестве редукторов объективы Т43 (от ф/а Смена-8), Индустар-26 или Гелиос-44. Объектив самой вэб-камеры, естественно, во всем этом не участвует. В данном опыте я решил обойтись без редукторов, т.к. изображение одной частицы пыльцы вполне умещается в размер матрицы. При таком мизерном поле зрения отсутствие план-коррекции у моего объектива уже не важно, вот только ХРУ у него ненулевое.

Второй важный момент – это возможность выбора цветового пространства и сжатия в драйвере камеры. Моя камера по умолчанию предлагает сжатие MJPG, но допускает выбор YUY2. Важно: выбираем YUY2, при MJPG будет потеря разрешения за счет размытия на резких границах в изображении. Камеры, где возможно только сжатие MJPG, не очень пригодны для такой съемки. Профессионалы используют RAW-формат.

Третий момент: выбор разрешения. Моя матрица имеет физическую размерность 2МП (1600х1200 пикселей). Сжатие YUY2 позволяет сформировать из 1600х1200 пикселей изображение 800х600 пикселей с минимальными потерями качества. Устанавливаем 800х600.

Четвертый момент: формат сохранения полученных файлов. Зависит от имеющегося ПО. Я использую для микрофотосъемки программу Micam версии 1.4, она предлагает сохранение в форматах jpg, png и bmp. Конечно, сохраняем не в jpg. Я предпочитаю bmp, хотя и в png сжатие идет без потери качества.

Продолжение в следующем посте…

Сперва несколько отдельных снимков. Для выкладки на сайт фото преобразованы в jpg.

Замечание: пока камера переставлялась на адаптер без редуктора, на матрицу налетела пыль; убирать ее сейчас нет желания, поэтому будем это иметь ввиду (укажу на картинках)..

Фото 1. В фокус попадают только верхушки нескольких шипов. Они светлее окружающего фона. На результирующем снимке эти верхушки будут «съедены» элементами, которые темнее.

Фото 2. В фокусе основание центрального шипа. Видны черные пятнышки, по-видимому, это поры, проходящие через стенку частицы. Структура этих пор будет или потеряна на результирующем снимке, или показана с плохим разрешением. Также видны светлые верхушки других шипов (А и Б).

Фото 3. В фокусе основания шипов А и Б, верхушки которых были видны на фото 2. Опять видна структура с темными пятнышками. В центре мы видим уже внутренность самой частицы.

Фото 4. Обратите внимание на отмеченный шип. Он светлый. В его основании просматриваются темные поры.

Фото 5. Обратите теперь внимание на тот же самый шип. Теперь он темный, а поры в основании светлые.

Смена яркости шипа от фото 4 к фото 5 происходит при совсем небольшом перемещении тубуса. Обусловлено это, наверное, явлениями дифракции (размеры мелких элементов сравнимы с длиной волны света). Программы стекинга очень не любят такие «фокусы» с яркостью элемента, они попросту теряются и не понимают, в результирующей картинке оно должно быть светлым или темным? Вот это, по моим наблюдениям, и является основной проблемой стекинга с объективами больших увеличений.

Теперь о глубине резкости. Программа Micam позволяет измерять размеры и расстояния, если ее прокалибровать с помощью объектов известных размеров, например, с помощью объект-микрометра. Это достаточно сделать один раз для каждого объектива и каждого адаптера камеры. Все приведенные мною размеры получены именно таким образом. По последним двум фото определяем, что а) диаметр шарика пыльцы составляет 28 мкм, высота одного шипа колеблется от 5 до 6 мкм. На фото 2 мы видим верхушки шипов А и Б, на фото 3 – их основания; от центра изображения до оснований примерно по 7,5 мкм. Из элементарной геометрии оцениваем угол наклона шипа к вертикали – чуть более 30 градусов. Таким образом, видимая проекция шипа примерно в 2 раза меньше его натуральной величины. Если считать, что в резкости лежат темные части шипов А и Б (а это около 1,5 мкм на картинке), то глубину резкости можно оценить в 3 мкм.

Продолжение в следующем посте...

Теперь о процедуре фотосъемки для последующего стекинга. Важным условием правильной работы программ наложения является строгое соблюдение шага вертикального перемещения тубуса при съемке. Не всякий микроскоп имеет механизм микроподачи, пригодный для стекинга. В частности, Владимир, Ваш Юннат не приспособлен для стекинга. Ваши, Игорь, МБИ отлично подходят, если в них механизмы Мейра нормально работают. Цена деления шкалы винта микрофокусировки составляет у Вас, кажется, 2 мкм. Мой БИОЛАМ имеет более простой механизм микрофокусировки, чем МБИ, и у него регулирующий диск механизма в основании штатива не имеет шкалы. Я снабдил этот диск шкалой, цена деления на нем получилась 5 мкм. Но для нашего случая (помните оценку глубины резкости – 3 мкм) это очень грубо. Поэтому в нарушение правил я буду делать снимки с более мелким шагом «на глаз».

Я пользовался: двумя программами стекинга: Helicon Focus v5.1 и PICOLAY. Helicon Focus может работать с форматом RAW, но у меня этого формата нет. Зато PICOLAY распространяется свободно. Обе программы имеют настройки процесса наложения кадров. Я пользуюсь ими интуитивно.

Снималось на другой день с другой настройкой освещения и, судя по всему, с другой частицей в поле зрения.

На картинке 1 – результат работы PICOLAY «как есть». Светлые ореолы вокруг шипов – последствие того самого изменения яркости, о котором я писал выше.

На картинке 2 – этот же результат, но с включенными настройками (их в PICOLAY всего 4). Исппользованы sharp_min10 и wa40.

На картинке 3 – второй снимок с почищенным фоном и наложенным масштабом.

На картинке 4 – результат Helicon Focus. В этой программе 3 параметра настройки стекинга. Использованы M=A, R=20, S=1

В зависимости от параметров стекинга вид результата меняется существенно, но общий момент – потеря деталей и появление артефактов. Контрастность и баланс белого можно доработать. Но на предельных увеличениях хорошего результата мне не удается получить.

Резюме: стекинг - это инструмент, которым можно пользоваться в определенных случаях, но нужно понимать, что объемность картинки и кажущаяся глубина резкости оплачиваются потерей разрешения, исчезновением мелких деталей и появлением артефактов.

А вот с объективами малых и средних увеличений на моем малобюджетном оборудовании получаются вполне сносные картинки, на которые мне приятно смотреть. Поэтому и пользуюсь. Вот, к примеру, картинка 5, объектив 20х, «Два Солнца».

Очень полезная тема! Наглядно и понятно, спасибо!

Даже и не мечтал. Просто было интересно как добиваются такой глубины. Вы объяснили предельно ясно, спасибо.

попробовал, фото iPhone сохраняет только в jpeg, вот что получилось:


загрузить несколько фоток чего-то не получается

Уменьшайте размер файла картинки - в одном посте можно размещать несколько фото, но не более 800Кб.

Как быстро загрузить большое количество картинок на наш форум?
viewtopic.php?f=14&t=12158

спасибо за подсказку

В дополнение к теме стекинга:

Один коллега посоветовал мне обратить внимание на программу устранения расфокусировки SmartDeblur. Данная программа работает с одним снимком, это не стекинг. Версия SmartDeblur 1.27 доступна для свободного скачивания и использования без лицензионного ключа совершенно официально, ее легко найти в Инете. Разумеется, чудес не бывает, и тут тоже увеличение четкости (усиление контраста мелких деталей) происходит за счет потери САМЫХ МЕЛКИХ деталей.

Пример применения этой программы с изображением, полученным через объектив 90х/1,25 на фото 1 и 2: разница небольшая, но если присмотреться или использовать БЛИНК КОМПАРАТОР (программа сравнения двух снимков для астрономов-любителей), то ее можно заметить. Нужно учесть, что для размещения на сайте снимки преобразованы в jpg, что несколько нивелирует различия. Разумеется, у SmartDeblur есть разные настройки процесса обработки изображения, можно достигнуть и бОльшего эффекта, но ценой потери более крупных деталей картинки. Использованные настройки: Defect type: Out of Focus Blur; Radius: 2.7; Smooth: 99%; Correction Strenght: 15; Edge Feather: 30%. Если я правильно понимаю суть программы (а, возможно, я ошибаюсь), то указав в настройках размеры куружка Эйри для данного объектива и распределение яркости внутри него можно в определенной мере уменьшить дифракционное размытие на границах объектов.

О препарате. Эпидерма листа тюльпана; окраска: азур + хризоидин; заключение в полистирол без покровного стекла, специально для наблюдения с маслянной иммерсией. Цель: рассмотреть структуры в ядре клетки.